El an\u00e1lisis de polimorfismos de una s\u00f3la base (SNPs) se basa en el uso de cebadores espec\u00edficos que terminen justo antes de la base a determinar. Se realiza una reacci\u00f3n de PCR s\u00f3lo con los 4 didesoxinucle\u00f3tidos marcados cada uno con un fluor\u00f3foro diferente. La detecci\u00f3n de la base incorporada revela la presencia\/ausencia de polimorfismo.<\/p>\n
Se pueden analizar varios SNPs en el mismo capilar puesto que el sistema permite la inyecci\u00f3n consecutiva de varias reacciones. Para ello se ha de utilizar un \u00abmarcador de inyecciones m\u00faltiples\u00bb.<\/p>\n
El usuario puede entregar las reacciones de SNPs ya preparadas para su electroforesis o entregar al Servicio los productos de PCR.<\/p>\n
Si el usuario entrega las reacciones ya preparadas se le aplicar\u00eda la tarifa correspondiente a \u00abS\u00f3lo electroforesis\u00bb (ver tarifas m\u00e1s adelante).<\/p>\n
Si el usuario entrega el producto de PCR y los cebadores correspondientes el Servicio se har\u00eda cargo de hacer la reacci\u00f3n para SNPs y de su an\u00e1lisis por electroforesis y se le aplicar\u00eda la tarifa correspondiente a \u00abAn\u00e1lisis de SNPs\u00bb (ver tarifas m\u00e1s adelante).<\/p>\n
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El an\u00e1lisis de SNPs mediante la tecnolog\u00eda de “pyrosequencing” se basa en la liberaci\u00f3n de PPi por cada nucle\u00f3tido incorporado durante el proceso normal de elongaci\u00f3n de la cadena naciente de DNA.<\/p>\n
De esta forma, se parte de un DNA molde monocatenario (fragmento de PCR desnaturalizado y marcado con biotina) al que se a\u00f1ade un “primer” espec\u00edfico (que acabe unas pocas bases antes del SNP) y una mezcla formada por los dNTPs y 4 enzimas: DNA Polimerasa, ATP Sulfurilasa, Luciferasa y Apirasa, junto con los sustratos APS y Luciferina.<\/p>\n
Tal como se dijo, por cada dNTP incorporado se libera una mol\u00e9cula de PPi. Mediante una reacci\u00f3n en cadena en la que intervienen la Sulfurilasa y la Luciferasa se produce un pulso de luz que es captado a tiempo real por el detector CCD.<\/p>\n
Si el dNTP a\u00f1adido no es el complementario a la base correspondiente no habr\u00e1 elongaci\u00f3n, no se producir\u00e1 PPi ni emisi\u00f3n de luz y actuar\u00e1 la Apirasa transform\u00e1ndolo en dNDP, evitando, por tanto, interferencias en la siguiente adici\u00f3n de dNTPs. La secuencia final obtenida es analizada por el software que detectar\u00e1 la presencia\/ausencia del SNP y su composici\u00f3n en bases.<\/p>\n
El usuario se har\u00e1 cargo de la amplificaci\u00f3n mediante PCR de su DNA de inter\u00e9s.<\/p>\n
Para ello es requisito indispensable que uno y s\u00f3lo uno de los dos “primers” para la amplificaci\u00f3n est\u00e9 biotinilado. Deber\u00e1 entregar al Servicio el producto de PCR (de 1 a 96 muestras) en formato placa de 96 pocillos.<\/p>\n
Deber\u00e1 tambi\u00e9n entregar un “primer” de secuenciaci\u00f3n convencional (sin marcaje) cuyo extremo 3’ diste unos pocos nucle\u00f3tidos del SNP que se quiere caracterizar.<\/p>\n
El Servicio dispone de un software espec\u00edfico para el dise\u00f1o de los “primers” de amplificaci\u00f3n y secuenciaci\u00f3n, indicando adem\u00e1s cu\u00e1l de los dos “primer” de amplificaci\u00f3n debe estar biotinilado, si bien, cualquier dise\u00f1o de “primers” y protocolo de PCR contrastado puede servir.<\/p>\n
En este \u00faltimo caso solo utilizar\u00edamos el software para el dise\u00f1o del “primer” de secuenciaci\u00f3n.<\/p>\n
* El Servicio se har\u00e1 cargo de llevar a cabo las reacciones de desnaturalizaci\u00f3n, eliminaci\u00f3n de la cadena no biotinilada, hibridaci\u00f3n con los “primers” de secuenciaci\u00f3n, elongaci\u00f3n de las cadenas mediante “pyrosequencing” y generaci\u00f3n de los correspondientes resultados.<\/p>\n
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Esta t\u00e9cnica sirve para el \u00abscreenig\u00bb o detecci\u00f3n r\u00e1pida de polimorfismos (SNPs, inserciones, delecciones o variaciones del tama\u00f1o de los microsat\u00e9lites) bien en poblaciones con mutaciones inducidas (TILLING) o naturales (ECOTILLING). La t\u00e9cnica es capaz de detectar el polimorfismo y de localizar su posici\u00f3n de forma aproximada, pero no de decirnos qu\u00e9 base(s) se ha(n) modificado. Para obtener esa informaci\u00f3n ser\u00eda necesaria la secuenciaci\u00f3n posterior del polimorfismo.<\/p>\n
La t\u00e9cnica se basa en la electroforesis en gel de acrilamida de los DNA problema que han sido amplificados con dos primers, uno de ellos marcado con un fluor\u00f3foro que se excita a 685 nm (“IRD 700”) y el otro a 785 nm (“IRD 800”). Los fragmentos amplificados son desnaturalizados y renaturalizados entre ellos y\/o frente a un control, de manera que en las posiciones donde existan los polimorfismos no habr\u00e1 complementariedad total de las dos cadenas y se formar\u00e1n bucles u horquillas. Un posterior tratamiento con nucleasas espec\u00edficas romper\u00e1n las cadenas en los puntos desapareados gener\u00e1ndose dos fragmentos por cada corte, uno con marcaje IRD 700 y el otro con marcaje IRD 800. Dichos fragmentos, cuya suma de tama\u00f1os debe ser igual al tama\u00f1o del fragmento amplificado de partida, son separados electrofor\u00e9ticamente y detectados simult\u00e1neamente gener\u00e1ndose dos im\u00e1genes del gel durante la electroforesis, una por cada fluor\u00f3foro empleado, que pueden ser procesadas en software convencionales de tratamiento de im\u00e1genes. La superposici\u00f3n de ambas im\u00e1genes hace que la identificaci\u00f3n del polimorfismo sea muy exacta, eliminando pr\u00e1cticamente la posibilidad de falsos positivos.<\/p>\n
El dise\u00f1o de los \u00abprimers\u00bb y la amplificaci\u00f3n de los DNA problema correr\u00e1 a cargo de los usuarios. El Servicio llevar\u00e1 a cabo los procesos de desnaturalizaci\u00f3n, renaturalizaci\u00f3n, tratamiento con nucleasas y an\u00e1lisis electrofor\u00e9tico de los DNA.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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