Esta es la modalidad que ha estado realizando el Servicio hasta el momento, en ella se entregan las reacciones de secuenciaci\u00f3n ya preparadas para su an\u00e1lisis por electroforesis. Nosotros recomendamos utilizar el kit: MegaBACE DYEnamic ET dye terminator kit (Amersham biosciences) con eliminaci\u00f3n de terminadores mediante precipitaci\u00f3n con etanol o mediante el kit AutoSeq 96 Dye Terminator Clean-up (Amersham Biosciences).<\/p>\n
El usuario entregar\u00e1 un DNA plasm\u00eddico o producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua est\u00e9ril con un volumen m\u00ednimo de 20 µL. El Servicio se encargar\u00e1 de realizar la reacci\u00f3n de secuenciaci\u00f3n y la electroforesis.<\/p>\n
La concentraci\u00f3n cuantificada m\u00ednima que se exige es la siguiente:<\/p>\n
• Para DNA plasm\u00eddico: 100 ng\/µL
• Para producto de PCR: 50 ng\/µL<\/p>\n
El DNA plasm\u00eddico entregado deber\u00e1 estar libre de RNA, prote\u00ednas y sales. Ser\u00eda recomendable disponer de una foto del DNA en un gel de agarosa. El DNA producto de PCR deber\u00eda estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucle\u00f3tidos que interferir\u00e1n en la reacci\u00f3n de secuenciaci\u00f3n. Para su purificaci\u00f3n es recomendable usar ExoSAP-IT. Ver \u00abnotas importantes\u00bb m\u00e1s adelante.<\/p>\n
El usuario entregar\u00e1 un cultivo crecido de E.coli<\/em> y el Servicio se encargar\u00e1 de la purificaci\u00f3n del DNA, de la reacci\u00f3n de secuenciaci\u00f3n y de la electroforesis.<\/p>\n Se recomienda usar como cepas de E.coli<\/em> la DH5a , DH10-b o la XL1-Blue. El cultivo celular que debe entregar el usuario puede estar crecido:<\/p>\n <\/p>\n Se puede utilizar cualquier otro cebador sintetizado por el usuario que cumpla los siguientes requisitos:<\/p>\n <\/p>\n El \u00e9xito de la secuenciaci\u00f3n est\u00e1 \u00edntimamente relacionado con la calidad y pureza del DNA, pudiendo tambi\u00e9n influir la cepa bacteriana, el vector de clonaci\u00f3n y la naturaleza del fragmento a secuenciar. Ante esto, sobre todo en el caso de utilizar el servicio de secuenciaci\u00f3n a partir de DNA, la muestra debe estar libre de contaminantes como RNA, prote\u00ednas, sales, etc. Por ello como m\u00e9todo de extracci\u00f3n recomendamos el que utilizamos nosotros (GFX Micro Plasmid prep., Amersham Biosciences) si bien otros kits comerciales pueden dar buenos resultados.<\/p>\n Los m\u00e9todos manuales tipo \u00abboiling\u00bb tambi\u00e9n pueden dar buenos resultados, si bien es necesario el tratamiento posterior con fenol\/cloroformo, cloroformo, precipitaci\u00f3n con isopropanol y lavados con etanol. El m\u00e9todo de \u00ablisis alcalina\u00bb no es recomendable a no ser que vaya seguido de una purificaci\u00f3n posterior con el kit mencionado anteriormente o con el kit High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Molecular Biochemicals).<\/p>\n Los DNA producto de PCR tambi\u00e9n deben ser lo m\u00e1s puros posible. Los cebadores y los nucle\u00f3tidos no incorporados pueden originar interferencias en la reacci\u00f3n de secuenciaci\u00f3n. Es recomendable eliminarlos usando el kit ExoSAP-IT.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Modalidades S\u00f3lo Electroforesis Esta es la modalidad que ha estado realizando el Servicio hasta el momento, en ella se entregan las reacciones de secuenciaci\u00f3n ya preparadas para su an\u00e1lisis por electroforesis. Nosotros recomendamos utilizar el kit: MegaBACE DYEnamic ET dye terminator kit (Amersham biosciences) con eliminaci\u00f3n de terminadores mediante precipitaci\u00f3n con etanol o mediante el […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"parent":86,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"footnotes":""},"class_list":["post-153","page","type-page","status-publish","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/153","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=153"}],"version-history":[{"count":2,"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/153\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":155,"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/153\/revisions\/155"}],"up":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/86"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/servicios.unileon.es\/lti-ir\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=153"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}
Debe evitarse el uso de la cepa HB-101 y sus derivados, pues contienen gran cantidad de carbohidratos y endonucleasas. Tambi\u00e9n debe evitarse el uso de cepas de crecimiento pobre.<\/p>\n\n
Cebadores Disponibles<\/h3>\n
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NOTAS IMPORTANTES<\/h3>\n