La técnica de Ribotipado
El Ribotipado es un método que permite identificar y clasificar bacterias en función del los genes del RNA ribosomal.
Los genes del rRNA se encuentran dentro de las regiones mejor conservadas del genoma bacteriano. Existen varias copias de genes para el rRNA en cada célula y su número y localización específica en el cromosoma varían según las especies. Por tanto, los patrones de bandas (su número, tamaño e intensidad) del DNA cromosómico digerido e hibridado con sondas marcadas para los genes rRNA son específicos de cada cepa bacteriana, por lo que pueden ser utilizados para reflejar diferencias a nivel de especies y subespecies, es decir, para identificar y caracterizar bacterias al comparar dichos patrones con los obtenidos a partir de bacterias conocidas.
La técnica del Ribotipado consiste en los siguientes procesos:
- Extracción y digestión del DNA a partir de una colonia bacteriana en placa.
- Separación mediante electroforesis de los fragmentos de DNA.
- Transferencia de los fragmentos separados a una membrana de Nylon.
- Hibridación con una sonda del operón rRNA de E. coli marcada químicamente.
- Adición de un conjugado enzima-anticuerpo que se une al marcaje de la sonda.
- Detección de las bandas mediante quimioluminiscencia.
- Análisis y comparación de las bandas frente a una base de datos, lo que permite la caracterización y presunta identificación de la cepa bacteriana.
El Riboprinter
Si se realiza de forma manual, la técnica de Ribotipado es larga y tediosa y podría llevarle a un operador experimentado unos dos días de trabajo. La adquisición por parte del Laboratorio de Técnicas Instrumentales del equipo “RiboprinterTM Microbial Chracterization System” ha permitido la total automatización del proceso con el consiguiente ahorro de tiempo, ausencia de errores de manipulación y una mayor capacidad de procesamiento de muestras: el equipo permite analizar hasta 48 muestras/día en bloques de 8 muestras cada 2 horas (el proceso total para cada bloque de 8 muestras lleva 8 horas, sin embargo, el equipo es modular, lo que permite iniciar un nuevo proceso sin haber completado el anterior, admitiendo bloques de 8 muestras cada dos horas).
Los 7 procesos de la técnica de Ribotipado descritos anteriormente se realizan de manera totalmente automática. El gel de agarosa donde se realiza la electroforesis consta de 13 pocillos, 8 para las muestras y 5 para marcadores de tamaño conocido. El software del Riboprinter usa la posición e intensidad de estos marcadores conocidos para normalizar el resto de bandas de la membrana permitiendo corregir y compensar las variaciones entre líneas y entre membranas, estandarizando el proceso y haciendo fácilmente comparables los resultados intra e inter laboratorios.
El patrón de bandas obtenido para cada muestra consistirá en una serie de bandas discretas de mayor o menor intensidad, a manera de “huella dactilar génica” o código de barras”.
El sistema comparará estas bandas con las obtenidas previamente, bien de microorganismos conocidos o bien de muestras desconocidas pero ya procesadas con anterioridad. Como resultado de esa comparación el software podra caracterizar la bacteria (agrupándola dentro de un “Ribogrupo” de bacterias con disposición de bandas muy similares o creando un nuevo “Ribogrupo” si la disposición de bandas es diferente a cualquiera de las procesadas hasta ese momento) y/o identificar a la bacteria comparando sus bandas con las de estándares conocidos presentes en bases de datos.
Aplicaciones
Cualquier aplicación derivada de la identificación y/o caracterización bacteriana, con la importante utilidad que esto puede tener en las empresas dedicadas al campo de la alimentación, de la salud y de la investigación.
La técnica de Ribotipado mediante el Riboprinter es una herramienta analítica que consigue unos niveles de información no alcanzables con los métodos microbiológicos clásicos. Por ejemplo, la técnica permite distinguir 40 cepas diferentes de L. monocytogenes mientras que sólo se diferencian 13 por serotipado convencional. El nivel de información obtenido es, pues, muy superior, lo que permite el análisis y resolución de problemas difícilmente abordables por métodos más convencionales.
Especialmente interesante se revela esta técnica en el control microbiológico de los procesos en la industria alimentaria en donde la contaminación bacteriana puede proceder de cualquiera de los ingredientes, del ambiente o de las personas implicadas en la producción. El Ribotipado permitiría establecer relaciones inequívocas entre los aislados bacterianos recuperados de estas fuentes y el producto procesado.
En cuanto al campo de la Salud, la rapidez y fiabilidad en la identificación bacteriana de esta técnica la hacen muy adecuada para la rápida identificación de las fuentes de infección en hospitales, lo que posibilitaría tomar las medidas preventivas y paliativas más adecuadas en cada caso.
La potencialidad de la técnica es también muy elevada en el campo de la medicina animal, así como en el mundo de la investigación básica y aplicada.
Solicitud de Análisis y Requisitos de las Muestras
Los usuarios que deseen solicitar el análisis deberán rellenar el “Formulario de Solicitud de Ribotipado”.
- Actualmente el Riboprinter sólo es aplicable a bacterias, no a hongos o levaduras.
- Los cultivos bacterianos deben traerse en placas y ser lo más recientes posibles (lo ideal sería que se recogiesen el mismo día en que se entreguen al Servicio). Es necesario contactar previamente con el personal del Laboratorio para iniciar el proceso nada más recibir las placas.
- Si se trata de una bacteria que forme esporas, las placas deben ser entregadas antes del proceso de esporulación.
- El usuario debe indicar al Servicio si se trata de bacterias Gram + o Gram -, pues el tratamiento de lisis es diferente.
- El usuario debe indicar al Servicio si se trata o no de bacterias lácticas o de Actinomicetos ya que en estos casos el procedimiento es ligeramente diferente.
- Se deberá también suministrar al Servicio toda la información previa disponible sobre la identificación de la bacteria que se va a ribotipar.
- Se deberá indicar al Servicio la enzima con la que se desea hacer la digestión del DNA. Actualmente el Servicio dispone de kits de ribotipado para la enzima EcoRI.
Tarifas
Para los usuarios de la Universidad de León 60 € por ribotipado.
Para otros Organismos Públicos: 75 € por ribotipado.
Para Empresas o Particulares: 90 € por ribotipado.
