A- Mediante el Secuenciador Automático MegaBACE 500

El análisis de polimorfismos de una sóla base (SNPs) se basa en el uso de cebadores específicos que terminen justo antes de la base a determinar. Se realiza una reacción de PCR sólo con los 4 didesoxinucleótidos marcados cada uno con un fluoróforo diferente. La detección de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo.

Se pueden analizar varios SNPs en el mismo capilar puesto que el sistema permite la inyección consecutiva de varias reacciones. Para ello se ha de utilizar un «marcador de inyecciones múltiples».

Requisitos de las Muestras

El usuario puede entregar las reacciones de SNPs ya preparadas para su electroforesis o entregar al Servicio los productos de PCR.

Si el usuario entrega las reacciones ya preparadas se le aplicaría la tarifa correspondiente a «Sólo electroforesis» (ver tarifas más adelante).

Si el usuario entrega el producto de PCR y los cebadores correspondientes el Servicio se haría cargo de hacer la reacción para SNPs y de su análisis por electroforesis y se le aplicaría la tarifa correspondiente a «Análisis de SNPs» (ver tarifas más adelante).

Requisitos de los productos de PCR:

• Longitud mínima de 350 pb
• Purificados con ExoI/SAP (Amersham ofrece el kit Exo/SAP-IT™).
• Se han de entregar al menos 50 ng de producto de PCR en un volumen de 10 µl.

Requisitos de los cebadores:

• Deben haber sido purificados mediante HPLC.
• Longitud comprendida entre 18 y 25 nt (que acaben justo antes de los SNPs correspondientes).
• Concentración: 2 µM.
• No deben formar estructuras secundarias (las últimas 3 bases del extremo 3′ no deben ser complementarias a ninguna otra región del cebador).
• Evitar el uso del desoxinucleótido G en posición 3′ terminal.

 

B- Mediante el equipo de Pyrosecuenciación PSQ^TM96 MA

El análisis de SNPs mediante la tecnología de “pyrosequencing” se basa en la liberación de PPi por cada nucleótido incorporado durante el proceso normal de elongación de la cadena naciente de DNA.

De esta forma, se parte de un DNA molde monocatenario (fragmento de PCR desnaturalizado y marcado con biotina) al que se añade un “primer” específico (que acabe unas pocas bases antes del SNP) y una mezcla formada por los dNTPs y 4 enzimas: DNA Polimerasa, ATP Sulfurilasa, Luciferasa y Apirasa, junto con los sustratos APS y Luciferina.

Tal como se dijo, por cada dNTP incorporado se libera una molécula de PPi. Mediante una reacción en cadena en la que intervienen la Sulfurilasa y la Luciferasa se produce un pulso de luz que es captado a tiempo real por el detector CCD.

Si el dNTP añadido no es el complementario a la base correspondiente no habrá elongación, no se producirá PPi ni emisión de luz y actuará la Apirasa transformándolo en dNDP, evitando, por tanto, interferencias en la siguiente adición de dNTPs. La secuencia final obtenida es analizada por el software que detectará la presencia/ausencia del SNP y su composición en bases.

Requisitos de las Muestras

El usuario se hará cargo de la amplificación mediante PCR de su DNA de interés.

Para ello es requisito indispensable que uno y sólo uno de los dos “primers” para la amplificación esté biotinilado. Deberá entregar al Servicio el producto de PCR (de 1 a 96 muestras) en formato placa de 96 pocillos.

Deberá también entregar un “primer” de secuenciación convencional (sin marcaje) cuyo extremo 3’ diste unos pocos nucleótidos del SNP que se quiere caracterizar.

El Servicio dispone de un software específico para el diseño de los “primers” de amplificación y secuenciación, indicando además cuál de los dos “primer” de amplificación debe estar biotinilado, si bien, cualquier diseño de “primers” y protocolo de PCR contrastado puede servir.

En este último caso solo utilizaríamos el software para el diseño del “primer” de secuenciación.

Requisitos de los productos de PCR:

• Amplificados mediante 25-50 ciclos partiendo de “primers” de 0,2 µM (uno de ellos biotinilado).
• Longitud entre 80 y 300 pb.
• Volumen entre 10 y 40 µl máximo.
• Para el diseño de estos “primers” el Servicio dispone de software específico.

Requisitos de los “primers” de secuenciación:

• Deben ser “primers” convencionales, sin ningún tipo de marcaje.
• El extremo 3’ debe estar próximo al SNP.
• La cantidad de primer necesario por cada muestra es de 40 µl de concentración 0,40 µM. El usuario deberá suministrar este primer concentrado (16 o 32 µM) para que el Servicio pueda diluirlo adecuadamente en el buffer de hibridación.
• Para el diseño de estos “primers” el Servicio también dispone de un software específico, tal y como hemos indicado.

* El Servicio se hará cargo de llevar a cabo las reacciones de desnaturalización, eliminación de la cadena no biotinilada, hibridación con los “primers” de secuenciación, elongación de las cadenas mediante “pyrosequencing” y generación de los correspondientes resultados.

 

C- Mediante el Analizador de DNA LI-COR Modelo 4300

Esta técnica sirve para el «screenig» o detección rápida de polimorfismos (SNPs, inserciones, delecciones o variaciones del tamaño de los microsatélites) bien en poblaciones con mutaciones inducidas (TILLING) o naturales (ECOTILLING). La técnica es capaz de detectar el polimorfismo y de localizar su posición de forma aproximada, pero no de decirnos qué base(s) se ha(n) modificado. Para obtener esa información sería necesaria la secuenciación posterior del polimorfismo.

La técnica se basa en la electroforesis en gel de acrilamida de los DNA problema que han sido amplificados con dos primers, uno de ellos marcado con un fluoróforo que se excita a 685 nm (“IRD 700”) y el otro a 785 nm (“IRD 800”). Los fragmentos amplificados son desnaturalizados y renaturalizados entre ellos y/o frente a un control, de manera que en las posiciones donde existan los polimorfismos no habrá complementariedad total de las dos cadenas y se formarán bucles u horquillas. Un posterior tratamiento con nucleasas específicas romperán las cadenas en los puntos desapareados generándose dos fragmentos por cada corte, uno con marcaje IRD 700 y el otro con marcaje IRD 800. Dichos fragmentos, cuya suma de tamaños debe ser igual al tamaño del fragmento amplificado de partida, son separados electroforéticamente y detectados simultáneamente generándose dos imágenes del gel durante la electroforesis, una por cada fluoróforo empleado, que pueden ser procesadas en software convencionales de tratamiento de imágenes. La superposición de ambas imágenes hace que la identificación del polimorfismo sea muy exacta, eliminando prácticamente la posibilidad de falsos positivos.

El diseño de los «primers» y la amplificación de los DNA problema correrá a cargo de los usuarios. El Servicio llevará a cabo los procesos de desnaturalización, renaturalización, tratamiento con nucleasas y análisis electroforético de los DNA.