Modalidades

Sólo Electroforesis

Esta es la modalidad que ha estado realizando el Servicio hasta el momento, en ella se entregan las reacciones de secuenciación ya preparadas para su análisis por electroforesis. Nosotros recomendamos utilizar el kit: MegaBACE DYEnamic ET dye terminator kit (Amersham biosciences) con eliminación de terminadores mediante precipitación con etanol o mediante el kit AutoSeq 96 Dye Terminator Clean-up (Amersham Biosciences).

A partir de DNA

El usuario entregará un DNA plasmídico o producto de PCR cuantificado y resuspendido en agua estéril con un volumen mínimo de 20 µL. El Servicio se encargará de realizar la reacción de secuenciación y la electroforesis.

La concentración cuantificada mínima que se exige es la siguiente:

• Para DNA plasmídico: 100 ng/µL
• Para producto de PCR: 50 ng/µL

El DNA plasmídico entregado deberá estar libre de RNA, proteínas y sales. Sería recomendable disponer de una foto del DNA en un gel de agarosa. El DNA producto de PCR debería estar purificado para eliminar los cebadores y el exceso de desoxinucleótidos que interferirán en la reacción de secuenciación. Para su purificación es recomendable usar ExoSAP-IT. Ver «notas importantes» más adelante.

A partir de cultivos

El usuario entregará un cultivo crecido de E.coli y el Servicio se encargará de la purificación del DNA, de la reacción de secuenciación y de la electroforesis.

Se recomienda usar como cepas de E.coli la DH5a , DH10-b o la XL1-Blue.
Debe evitarse el uso de la cepa HB-101 y sus derivados, pues contienen gran cantidad de carbohidratos y endonucleasas. También debe evitarse el uso de cepas de crecimiento pobre.

El cultivo celular que debe entregar el usuario puede estar crecido:

• En medio líquido: El usuario entregará el pellet a partir de 6 a 20 ml de cultivo (dependiendo del crecimiento) crecido preferiblemente en TB o 2xYT. El tiempo de incubación no deberá sobrepasar las 16 horas para evitar la lisis celular.
• En medio sólido: El usuario deberá entregar un cultivo que ocupe al menos 1/2 de placa Petri. El cultivo deberá tener como máximo 3 días conservado a 4ºC.

 

Cebadores Disponibles

• M13 directo (-40): 5′ GTT TTC CCA GTC ACG ACG GTT GTA 3′
• M13 directo (-27): 5′ CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3′
• M13 reverso (-27): 5′ GGA AAC AGC TAT GAC CAT 3′
• T7: 5′ GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3′
• T3: 5′ TAA CCC TCA CTA AAG GGA 3′
• SP6: 5′ GCT ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA 3′

Se puede utilizar cualquier otro cebador sintetizado por el usuario que cumpla los siguientes requisitos:

• Longitud: 16-22 nucleótidos
• Concentración mínima: 5 µM
• % GC: 40-50%
• Tm: entre 50 y 65º C.

 

NOTAS IMPORTANTES

El éxito de la secuenciación está íntimamente relacionado con la calidad y pureza del DNA, pudiendo también influir la cepa bacteriana, el vector de clonación y la naturaleza del fragmento a secuenciar. Ante esto, sobre todo en el caso de utilizar el servicio de secuenciación a partir de DNA, la muestra debe estar libre de contaminantes como RNA, proteínas, sales, etc. Por ello como método de extracción recomendamos el que utilizamos nosotros (GFX Micro Plasmid prep., Amersham Biosciences) si bien otros kits comerciales pueden dar buenos resultados.

Los métodos manuales tipo «boiling» también pueden dar buenos resultados, si bien es necesario el tratamiento posterior con fenol/cloroformo, cloroformo, precipitación con isopropanol y lavados con etanol. El método de «lisis alcalina» no es recomendable a no ser que vaya seguido de una purificación posterior con el kit mencionado anteriormente o con el kit High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Molecular Biochemicals).

Los DNA producto de PCR también deben ser lo más puros posible. Los cebadores y los nucleótidos no incorporados pueden originar interferencias en la reacción de secuenciación. Es recomendable eliminarlos usando el kit ExoSAP-IT.